细胞与基因治疗领域近年来取得显著进展，其中AAV载体采用三质粒共转染技术，CAR-T治疗基于慢病毒四质粒瞬转体系，二者已成为当前主流技术路径。行业快速发展导致GMP级质粒DNA需求骤增，然而传统大肠杆菌发酵工艺存在的污染风险和稳定性缺陷，严重限制了高质量质粒的规模化生产。

英国Touchlight公司开发的doggybone DNA（dbDNA）技术突破传统局限，利用phi29 DNA polymerase结合TelN Protelomerase的体外酶法合成体系，完全规避细菌培养环节，从源头消除发酵工艺风险。该技术不仅能简化生产流程，更能快速制备符合GMP标准的DNA产物，为DNA/mRNA疫苗模板制备及病毒载体生产提供了创新解决方案。

DNA酶法合成工艺流程

图1. DNA酶法合成流程图^[1]

整个dbDNA的生产流程简洁而高效，主要分为以下四步：

 01 

模板变性

环状质粒DNA模板通过变性处理，将其转化为两个单链环状DNA。

02 

滚环扩增

利用Phi29 DNA聚合酶以单链环状DNA为模板，进行滚环扩增，生成具有端粒酶识别序列间隔的长线性双链多联体DNA。

03 

切割及共价闭合

TelN端粒酶识别多联体DNA上的端粒酶识别序列（telRL）发挥切割和连接活性，生成线性、末端共价连接DNA单体。

04 

去除细菌骨架DNA

限制性内切酶或核酸外切酶降解末端具有开放结构的细菌骨架DNA得到仅含有目标基因表达元件的DNA。

为推动DNA酶法合成技术的发展，翌圣生物可提供DNA酶法合成的核心酶原料：phi29 DNA polymerase（14404ES）及TelN Protelomerase（14540ES）等，助力DNA酶法合成技术研发生产。

phi29 DNA polymerase（14404ES）

phi29 DNA polymerase具有卓越的链置换和持续合成能力，可合成长达70 kb的DNA片段。此外，其3’→5’核酸外切酶校读活性较强，其保真度高于目前绝大多数DNA聚合酶，确保了DNA合成的高保真性。这些显著的优势使得phi29 DNA聚合酶在多种DNA扩增技术中得到了广泛应用，如多重置换扩增（MDA）和滚环扩增（RCA）等。

图2. RCA原理图^[2]

A: 以单引物扩增产生长链DNA；B: 以随机引物扩增产生长链串联DNA

01

高灵敏度：可对pg级别的DNA模板进行有效扩增

图3. 翌圣及进口品牌phi29 DNA聚合酶不同DNA模板投入量扩增结果。C1:无模板对照，C2：无酶对照。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）灵敏度及扩增产量优于进口品牌

02

高扩增产量：100ng模板投入，产量可达2 μg/μL，有利于模板DNA等规模化放大

图4. 翌圣phi29 DNA聚合酶扩增产量。模板：293细胞gDNA，投入100ng；反应时间：16h。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）在100ng模板投入量下，扩增产量可达到2 μg/μL

翌圣TelN Protelomerase (14540ES)

TelN Protelomerase具有切割-连接活性，可用于合成线性闭合mini DNA载体，其在识别位点TelRL（56bp）切割双链DNA，并在酶切位点处留下共价封闭的发夹结构，有效地将环状DNA转化为有发夹末端的线性DNA。在实际应用中会将质粒上的目的片段和骨架序列通过TelRL位点进行间隔。

作用机制：

1）切割：TelN识别特定的DNA序列（telRL位点），并在该位点精确切割双链DNA。

2）连接：切割后，TelN将DNA末端共价连接，形成稳定的线性闭合结构。

图5. TelN端粒酶切割位点

01

切割-连接性能优异，与进口品牌相当

以含有TelN端粒酶识别位点的超螺旋质粒为模板，梯度加入（0.078-5 U）翌圣及进口品牌A*的TelN端粒酶将0.5 μg超螺旋质粒转换成封闭线性双链DNA，凝胶电泳检测转换效率，结果显示翌圣TelN端粒酶的切割-连接活性与进口品牌A*相当。

图6. TelN端粒酶切割活性检测 M：Marker，C：超螺旋质粒对照

02

双链DNA末端闭合完整性>90%

以含有TelN端粒酶识别位点的超螺旋质粒为模板，加入翌圣及进口品牌A*的TelN端粒酶，将0.5 μg超螺旋质粒转换为封闭线性双链DNA，再加入T5核酸外切酶通过条带降解程度来检测其末端完整性，结果显示翌圣的TleN端粒酶生成的双链DNA末端闭合完整性>90%，与进口品牌A*相当。

图7. TelN端粒酶末端闭合完整性检测

C1：含TelN识别位点质粒，不加TelN端粒酶与T5核酸外切酶；

C2：含TelN识别位点质粒，加TelN端粒酶，不加T5核酸外切酶；

A*：含TelN识别位点质粒，加A*的TelN端粒酶，加T5核酸外切酶；

Yeasen：含TelN识别位点质粒，加Yeasen的TelN端粒酶，加T5核酸外切酶

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*在某些应用场景下，使用此酶会有专利限制。

参考文献

[1] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.

[2] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomere and telomerase biology. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40. 

[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.

[4] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.